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藥敏實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)步驟: 1.菌懸液制作:用接種環(huán)挑取待測(cè)菌落至生理鹽水或磷酸鹽緩沖液中振蕩均勻制成 約0.5麥?zhǔn)蠞岫?約108-109CFU/mL )的菌懸液。 2.接種:用無(wú)菌棉拭子蘸取菌懸液均勻涂抹至海博生物MH平板,放置室溫片刻至表面稍干。 3.貼片:用無(wú)菌鑷子將抗生素紙片均勻貼布于平皿瓊脂表面,一旦紙片接觸平皿表面 ,不可再移動(dòng),各紙片間中心間距不得小于24mm,紙片距平皿邊緣不得小于15mm. 紙片貼完后,放置約15-30min后,將平皿置于35℃倒置培養(yǎng)18-24h。 4.結(jié)果觀察: 培養(yǎng)結(jié)束后取出平板,可發(fā)現(xiàn)紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈,用尺子測(cè)量抑菌圈的大小。抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度,并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。
  
氧化酶實(shí)驗(yàn)視頻
操作步驟: 1.用移液槍吸取無(wú)菌水,滴加于氧化酶試紙上。 注意:以剛剛浸濕為宜。若試紙過(guò)濕會(huì)阻礙空氣與菌苔接觸,從而會(huì)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,造成假陰性。 2. 用一次性接種針挑取單個(gè)菌落。 注意:不能使用含鐵金屬制成的接種環(huán)或接種針進(jìn)行實(shí)驗(yàn),鐵等金屬可催化二甲基對(duì)苯二胺變色,造成假陽(yáng)性。 3. 將菌落涂抹于試紙上,觀察顏色反應(yīng),2min內(nèi)不變色為陰性。 4. 相同的方法涂抹另一種細(xì)菌于試紙上,30s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為陽(yáng)性。 氧化酶試紙的保存: 二甲基對(duì)苯二胺易氧化,氧化酶試紙應(yīng)裝在深色瓶中,并于2-8℃保存。正常情況下氧化酶試紙為白色,若變色則不宜使用。
  
芽孢染色實(shí)驗(yàn)操作
實(shí)驗(yàn)原理: 芽孢壁厚,透性低,著色、脫色困難,利用著色力強(qiáng)的染色劑在加熱條件下染色時(shí),染料同時(shí)進(jìn)入菌體和芽孢。進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色,而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出,若再用復(fù)染液染色后,芽孢仍然保留初染劑的顏色,而菌體被染成復(fù)染液的顏色,即菌體和芽孢分別被染成紅色和綠色來(lái)區(qū)分。 操作步驟: 1. 取一個(gè)載玻片,在其中央滴一滴去離子水,用接種環(huán)蘸取少量菌體于去離子水中,涂抹均勻,待干燥后,在火焰上過(guò)3次以固定; 2. 滴加3-4滴A液于已經(jīng)固定的涂片上; 3. 用鑷子夾住載玻片在火焰上持續(xù)加熱6-8s(可續(xù)加染液以防其蒸干); 4. 加熱完畢待玻片冷卻后,傾去染液,水洗至不再褪色為止; 5. 用B液復(fù)染1min,水洗至流出液無(wú)色。待玻片干燥后,轉(zhuǎn)移至顯微鏡油鏡下觀察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 枯草芽孢桿菌的芽孢呈綠色,菌體呈紅色。 注意事項(xiàng): 1. 只有在加熱條件下芽孢滲透性發(fā)生變化,才能將其染色; 2. 第3步,持續(xù)加熱6-8s要使染液冒蒸汽但不能沸騰,并且不能蒸干。
  
血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)步驟: (1)首先取一盒海博生物凍干兔血漿,按瓶蓋上箭頭方向掀開并撕下鋁箔蓋 (2)用鑷子打開西林瓶膠塞。 (3)用移液槍吸取0.8ml新鮮的BHI肉湯培養(yǎng)物,加入西林瓶中。 “新鮮”即為,培養(yǎng)物從培養(yǎng)箱取出后,立即進(jìn)行試驗(yàn)。以保證培養(yǎng)物酶活力良好。避免出現(xiàn)因取出一段時(shí)間后,因酶活力降低而引起的假陰性。 也可以每支西林瓶中加入0.5ml滅菌生理鹽水輕微搖晃至完全溶解,然后加入0.3ml肉湯培養(yǎng)物。 (4)之后塞上膠塞,輕輕搖動(dòng)瓶身至混合均勻,注意不要采取劇烈搖晃的方式,之后置36℃?1℃培養(yǎng)。 結(jié)果觀察: 每半小時(shí)觀察一次,觀察6h, 觀察時(shí)采用將西林瓶緩慢傾斜或倒置的方式,切記不要?jiǎng)×覔u晃,如凝固為陽(yáng)性,不凝固則為陰性。 實(shí)驗(yàn)原理: 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生游離凝固酶,釋放于血漿中,被血漿中的凝固酶致活因子激活后變成耐熱的凝固酶樣物質(zhì),此物質(zhì)使纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白,血漿因而凝固。 特別提醒: 試驗(yàn)必須每半小時(shí)觀察一次,不可直接觀察6h后的結(jié)果。一些金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生蛋白酶來(lái)分解纖維蛋白,而出現(xiàn)先凝集而后消融的情況,所以需每半小時(shí)觀察一次,防止因觀察不及時(shí),而誤判成假陰性。
  
硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)
所需試劑: 1、硝酸肉湯生化管:有GB033、SN047、GB182等多種配方,適用于不同細(xì)菌的硝酸鹽還原試驗(yàn),可根據(jù)具體需要選用。本視頻以GB033為例介紹。 2、GB129硝酸鹽(產(chǎn)氣):用于細(xì)菌的硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)。 3、HB8282硝酸鹽還原試劑盒:與硝酸鹽肉湯配套使用,用于結(jié)果觀察。 試驗(yàn)菌的接種: 1、GB033:打開安瓿瓶,接種試驗(yàn)菌,36?1℃培養(yǎng)18-24h。 2、GB129:使用前需將小倒管中氣體排出,打開管蓋,接種試驗(yàn)菌,36?1℃培養(yǎng)20-24h,注意專性需氧菌培養(yǎng)時(shí)不能將管蓋擰緊。 結(jié)果判斷及原理: 1、GB033:接種試驗(yàn)菌培養(yǎng)后的硝酸鹽肉湯需滴加硝酸鹽還原試劑來(lái)檢驗(yàn)硝酸鹽是否被利用生成亞硝酸鹽。 ①若試驗(yàn)菌利用硝酸鹽生成亞硝酸鹽,亞硝酸鹽與試劑反應(yīng)生成紅色物質(zhì),則滴加試劑后呈紅色(陽(yáng)性); ②若試驗(yàn)菌利用硝酸鹽生成氨,則滴加試劑為無(wú)色,此時(shí)繼續(xù)加入適量鋅粉,仍不變紅,證明培養(yǎng)物中無(wú)硝酸鹽的存在(全部被利用),硝酸鹽還原試驗(yàn)依然判為陽(yáng)性; ③若試驗(yàn)菌不利用硝酸鹽,則滴加試劑為無(wú)色,繼續(xù)加入鋅粉后溶液變紅,證明硝酸鹽未被利用,結(jié)果判定為陰性。 2、GB129:若試驗(yàn)菌利用硝酸鹽生成氮?dú)?,則小倒管中囤積氣體,判定為陽(yáng)性;小倒管中無(wú)氣體,則判定為陰性。 鋅粉的作用: 鋅粉可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽繼續(xù)與硝酸鹽還原試劑發(fā)生紅色反應(yīng)因此可以用鋅粉來(lái)檢驗(yàn)培養(yǎng)基中是否還含有硝酸鹽,從而幫助判斷反應(yīng)的陰陽(yáng)性。 注意事項(xiàng): 某些細(xì)菌利用硝酸鹽緩慢可延長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng),結(jié)果為陽(yáng)性依然可判定為硝酸鹽還原陽(yáng)性。
  
衛(wèi)矛醇半固體實(shí)驗(yàn)操作
操作步驟: 1.取一支衛(wèi)矛醇半固體生化管,做好標(biāo)記,在瓶頸上方藍(lán)點(diǎn)處掰開安瓿瓶,備用。 2.用接種針挑取試驗(yàn)菌苔,穿刺接種于海博生物衛(wèi)矛醇半固體生化管中,穿刺接種約培養(yǎng)基1/2深度。本實(shí)驗(yàn)以傷寒沙門氏菌,鼠傷寒沙門氏菌,福氏志賀氏菌為例進(jìn)行試驗(yàn)。之后放置于36℃培養(yǎng)24 h。 3.培養(yǎng)結(jié)束后取出生化管觀察,發(fā)現(xiàn)接種福氏志賀氏菌的生化管,穿刺線清晰,未擴(kuò)散,說(shuō)明該菌無(wú)鞭毛,無(wú)動(dòng)力;接種傷寒沙門氏菌,鼠傷寒沙門氏菌的生化管,穿刺線周圍有擴(kuò)散現(xiàn)象,說(shuō)明該菌有鞭毛,有動(dòng)力。其中,接種鼠傷寒沙門氏菌的生化管變黃,為陽(yáng)性結(jié)果,這是因?yàn)樵摼馨l(fā)酵衛(wèi)矛醇產(chǎn)酸,使培養(yǎng)基的pH下降,指示劑顏色變黃。若不能發(fā)酵衛(wèi)矛醇,則培養(yǎng)基顏色不變,為陰性結(jié)果。 結(jié)果觀察: 培養(yǎng)結(jié)束后取出生化管觀察 發(fā)現(xiàn)接種福氏志賀氏菌的生化管,穿刺線清晰,未擴(kuò)散,說(shuō)明該菌無(wú)鞭毛,無(wú)動(dòng)力; 接種傷寒沙門氏菌,鼠傷寒沙門氏菌的生化管,穿刺線周圍有擴(kuò)散現(xiàn)象,說(shuō)明該菌有鞭毛,有動(dòng)力。 接種鼠傷寒沙門氏菌的生化管變黃,為衛(wèi)矛醇陽(yáng)性結(jié)果,這是因?yàn)樵摼馨l(fā)酵衛(wèi)矛醇產(chǎn)酸,使培養(yǎng)基的pH下降,指示劑顏色變黃。若不能發(fā)酵衛(wèi)矛醇,則培養(yǎng)基顏色不變,為陰性結(jié)果。
  
MUCAP實(shí)驗(yàn)操作
為什么說(shuō)是快速篩選? 1、細(xì)菌經(jīng)分離培養(yǎng)后可直接滴加試劑觀察結(jié)果節(jié)省了后續(xù)的生化培養(yǎng)時(shí)間。 2、當(dāng)選擇性平板上有變形桿菌志賀氏菌或其他較多雜菌時(shí)可快速排除大多數(shù)雜菌的干擾提高分離效率。 操作步驟: 1、分離培養(yǎng):挑取待測(cè)菌菌懸液接種于添加了1%蔗糖的SS瓊脂平板(添加蔗糖,可排除發(fā)酵的沙雷氏菌的干擾)。之后36?1℃培養(yǎng)22-26小時(shí)。 2、滴加試劑:取一瓶海博生物MUCAP試劑,用移液槍吸取適量試劑,滴加在可疑菌落上。 3、結(jié)果觀察:用366nm紫外光照射,有藍(lán)色熒光的為MUCAP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,沙門氏菌菌落可觀察到藍(lán)白色熒光。 實(shí)驗(yàn)原理: 沙門氏菌可特異的分解MUCAP試劑(4-甲基傘形酮辛酯)中的辛酯,?使4-甲基傘形酮游離,游離的4-甲基傘形酮可在紫外光燈照射下可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。
  
三糖鐵實(shí)驗(yàn)操作
簡(jiǎn)介: 三糖鐵試驗(yàn)常用于沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌等致病菌的生化鑒定和初篩。相比較于克氏雙糖鐵,三糖鐵中增加了蔗糖,擴(kuò)大了非目標(biāo)菌的排除范圍,增加了初篩的能力。 注:做弧菌的生化鑒定時(shí),通常使用含1%或3%氯化鈉的三糖鐵瓊脂。 第一步:培養(yǎng)基制備 若使用干粉培養(yǎng)基自行制備三糖鐵斜面需要注意配時(shí)一定要加熱煮沸并不停攪拌至瓊脂完全溶解,才能分裝試管。不然會(huì)因?yàn)榄傊瑳](méi)有完全溶解,造成有些試管不凝固,或凝固不完全的情況。 將分裝好的試管放入滅菌鍋滅菌。滅菌結(jié)束后,將試管擺成高層斜面狀,斜面/底層 ≈ 2/3 若使用一次性塑料試管,則需將培養(yǎng)基滅菌后再進(jìn)行無(wú)菌分裝,擺高層斜面。(畫面:一次性塑料試管圖片)。也可直接使用海博生物成品三糖鐵管進(jìn)行實(shí)驗(yàn),免去繁瑣的配制過(guò)程。 第二步:接種待測(cè)菌 用接種挑取待測(cè)菌落,在斜面上“之”字形劃線,再于底層穿刺(穿刺底層深度2/3左右即可),培養(yǎng)過(guò)程中必須確保試管透氣性良好,使用成品三糖鐵管時(shí)不可將蓋子蓋緊之后將培養(yǎng)基置于36?1℃培養(yǎng)18-24h后,觀察結(jié)果。 現(xiàn)象觀察 斜面或底層 若為紅色,則為產(chǎn)堿,常用“K”表示;若出現(xiàn)變黃,則為產(chǎn)酸,常用“A”表示; 底層若有變黑出現(xiàn),則為硫化氫陽(yáng)性;若底層出現(xiàn)氣泡或瓊脂出現(xiàn)斷層,則為產(chǎn)氣陽(yáng)性。 斜面紅、底層黃的K/A型: 此類細(xì)菌僅能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,不能發(fā)酵乳糖和蔗糖,如大多數(shù)的沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌等;斜面和底層均為黃色的A/A型: 此類細(xì)菌則至少能發(fā)酵乳糖和蔗糖其一,如大腸桿菌、普通變形桿菌、霍亂弧菌等; 斜面和底層均為紅色的K/K型: 此類細(xì)菌通常不能發(fā)酵葡萄糖或僅能有氧分解葡萄糖,如銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿桿菌等;多數(shù)沙門氏菌、大腸桿菌、變形桿菌可以產(chǎn)氣,出現(xiàn)氣泡或斷層;產(chǎn)硫化氫的沙門氏菌和變形桿菌等底部可以觀察到變黑現(xiàn)象。
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